El pasado 21 de marzo, se celebró el BioMinds Research Day en el Bioprocess Development and Training Complex en Mayagüez, Puerto Rico. Tuve la oportinidad de visitar tres afiches y discutir los proyectos con las estudiantes encargadas de los mismos.
El primer afiche, de la estudiante Sheila M. González del Recinto de Mayagüez, se titulaba “Water Quality in the Irrigation System from Lajas Valley: Presence and Quantification of Enterococci and Coliform Bacteria”. El propósito de este proyecto es evaluar la calidad de agua de los sistemas de irrigación del Valle de Lajas. Esto debido a que las aguas en el área están en constante exposición a desperdicios de la industria agrícola y ganadera, los cuales contribuyen a la posible contaminación de las mismas. Los resultados preliminares demuestran que el número más probable de Enterococcus, bacterias que comúnmente se encuentran en las heces fecales del ganado, es mayor al que es permitido para asegurar la calidad de las aguas. Sin duda, este es un proyecto de envengadura, ya que permite un monitoreo de aguas que son utilizadas para irrigar productos que últimamente consumimos y que, de no seguir las más estrictas normas de calidad, podría convertirse en una amenaza para la salud de los consumidores.
El segundo afiche se titula “Probing for Clinical Intergrons in Yogurt Bacteria”. El mismo pertenece a la estudiante Paloma G. Monroig del Recinto de Mayagüez. Este proyecto se propone explorar la presencia de integrones, componentes genéticos bacterianos que facilitan la captura y expresión de genes que codifican para alguna función adaptativa (ej. resistencia a antibióticos), en las bacterias encontradas en el yogurt. Esto mediante la extracción de DNA bacteriano de cuatro marcas de yogurt diferentes para evaluar la presencia o ausencia de tres clases de integrones de importancia clínica. En efecto, los resultados demostraron presencia de la clase 1 de integrones en tres de las cuatro marcas de yogurt. La aportación científica de este proyecto recae en que es de suma importancia reconocer las fuentes exógenas, en este caso productos lácteos, de bacterias que presenten la ocurrencia de integrones, para así limitar la posible transferencia de y, por ende, un aumento en la ocurrencia de genes que confieran resistencia a antibióticos.
El tercer afiche, titulado “Construction of a Small Size Insert Metagenomic Library Derived from Tabonuco Forest in Puerto Rico,” pertenece a la estudiante Amaris Torres Delgado, también del Recinto de Mayagüez. El propósito de este proyecto fue extraer DNA de bajo peso molecular del suelo del Bosque Tabonuco para generar un ‘metagenomic library.’ La metagenómica consiste en el análisis del genoma microbial extraído de muestras ambientales, utilizando acercamientos independientes al cultivo de dichos microorganismos. Este proyecto aporta a la comunidad científica al añadir al conocimiento ya establecido sobre las comunidades microbianas en esta zona, abriendo paso al posible descubrimiento de microorganismos antes no estudiados debido al desconocimiento sobre como manternerlos en cultivo.
BioMinds Research Day Abril 26, 2009
Abstract Febrero 28, 2009
25-hydroxycholesterol induces the differential expression of manganese
superoxide dismutase and the apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 in the human lymphoblastic leukemic CEM cells. Nicole Villafañe*, María del Rocío Castro† and Sylvette Ayala-Torres†. *University of Puerto Rico Río Piedras Campus and †University of Puerto Rico Medical Sciences Campus.
Oxysterols represent a vast family of natural cholesterol oxidation products that are potent inducers of apoptosis in leukemic lymphoid cells. The mechanism responsible for this process is unknown, but it has been suggested that increased generation of mitochondrial-generated reactive oxygen species may play an important role in the induction of lymphoid apoptosis. Previous work in our laboratory indicates that 25-hydroxycholesterol (25OHC), a potent oxysterol, induces apoptosis of human lymphoid leukemic CEM cells via the induction of mitochondrial DNA (mtDNA) damage. We hypothesize that 25OHC-induced apoptosis involves the regulation of the expression of two enzymes that localize to mitochondria: manganese superoxide dismutase (MnSOD) and the apurinic/apyrimidinic (AP) endonuclease 1 (APE1). MnSOD is an antioxidant protein that scavenges the superoxide anion and APE1 is involved in the repair of oxidative mtDNA damage. To test our hypothesis, we performed time course and dose-response studies after exposure of oxysterol-sensitive (CEMC7) and oxysterol-resistant (M10R5) cell clones to 25OHC and measured the expression of MnSOD and APE1 by Western blot analysis. Our results show a ~50% decrease in the expression of MnSOD in the oxysterol-sensitive CEMC7 cells at 24 and 48h, whereas levels of MnSOD expression increased in the oxysterol-resistant M10R5 cells only 48h after treatment with 1000 nM 25OHC. Treatment with 300 and 1000 nM 25OHC induced a statistically significant ~20% decrease in the expression of APE1 after 24 and 48h in the oxysterol-sensitive CEMC7 cells, while no significant changes were observed in the expression of APE1 in the oxysterol-resistant M10R5 cells. We conclude that 25OHC-induced apoptosis involves the differential expression of MnSOD and APE1, suggesting that both the antioxidant and repair pathways may play a role in the sensitivity of CEMC7 leukemic cells to undergo apoptosis. 25OHC may be a good candidate as a chemotherapeutic agent. Supported by the Amgen Bio-Minds Program.
Febrero 27, 2009
Todavía no he podido lograr ninguno de los objetivos establecidos, ya que el 2,7-dichlorofluorescein diacetate acaba de llegar esta semana. Comezaré los experimentos la semana que viene.
Enero 28, 2009
Este semestre tengo como objetivo el medir especies reactivas (RS) en las células linfoides humanas CEM tratadas con el agente apoptótico 25-hidroxicolesterol. Esto se debe a que nuestra hipótesis establece que 25OHC induce apoptosis por medio de la formación de radicales libres. La nueva metodología a utilizarse implica el uso del compuesto 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) el cual, al ser añadido a las células, es hidrolizado por esterasas celulares y luego es oxidado en presecia de RS, resultando en un compuesto fluorescente. La fluorescencia es entonces cuantificada para determinar la presencia de RS en la muestra.
Este trabajo se relaciona con el del semestre anterior, ya que intentamos medir directamente la producción de RS, mientras que en el pasado, medimos indirectamente mediante un enfoque en la expresión de dos proteínas, MnSOD y APE1, con propiedades antioxidantes y con funciones de reparación de mtDNA, respectivemente.
Las metas para este semestre constituyen llevar a cabo experimentos de dosis-repuesta para determinar la concentración óptima de DCFDA que no sea tóxica para nuestras células, así como experimentos de transcurso de tiempo luego que la concentración óptima sea determinada, todo esto sin tratar las células con 25OHC. Luego luego de tener una concentración y tiempo óptimo establecido, se pasará al diseño del experimento donde las células sean tratadas con 25OHC.
Noviembre 26, 2008
Se conoce que 25-hidroxicolesterol, un derivado de la oxidación de colesterol, induce apoptosis en las células linfoblásticas CEMC7. El mecanismo responsable de este proceso no se conoce, pero se ha sugerido que la producción de radicales libres de oxígeno puede jugar un papel importante. Se ha demostrado previamente en el laboratorio en el cual trabajo que la apoptosis inducida por 25OHC induce daño al DNA mitocondrial. Nuestra hipótesis es que este daño envuelve la regulación de las expresión de dos enzimas localizadas en la mitocondria. Éstas son: MnSOD, la cual tiene propiedades antioxidantes, y APE1, la cual actúa como una proteína de reparación en mtDNA. Para probar esta hipótesis, lo que hicimos fue exponer al clono sensitivo CEMC7 y al clono de células M10R5,que es resistente a apoptosis, a 25OHC. Luego hicimos un análisis de Western blot.
Como había mencionado anteriormente, este semestre me dediqué a analizar estadísticamente los datos de cuatro experimentos que se habían trabajado el semestre pasado. Esta vez se incluyeron membranas nuevas que ofrecían una mejor señal de las proteínas de interés, esto gracias a al desarrollo de un mejor manejo de la técnica de Western blot y de la aplicación de varias formas de “troubleshooting” que se consiguieron mediante un proceso de “trial and error.”
Los resultados para este semestre, en los cuales se observa una disminución en la expresión de MnSOD y APE luego del tratamiento con el agente apoptótico 25OHC en las células CEMC7, sugiere que la disminución de ambas proteínas podría jugar un papel importante en la sensitividad de este clono a 25OHC.
Hasta el momento, las metas para el próximo semestre incluyen la incorporación y análisis de datos de nuevos experimentos con MnSOD y APE1, así como experimentos en los cuales midamos la generación de radicales libres de oxígeno en ambos clonos de células, CEMC7 y M10R5.
Octubre 27, 2008
Hasta ahora he progresado bastante en la organización y análisis de datos. Me considero que estoy sobre el 50% pero menor del 80%, ya que parte de los objetivos del semestre incluyen una presentación al final del mismo. En cuanto a la contribución científica de mi proyecto, pienso que es uno de envergadura en el área de la salud, ya que el mismo pretende desarrollar un posible agente quimioterapeutico derivado de colesterol. En estos momentos, todavía el proyecto está lejos de posibles estudios clínicos, pero nos dirigimos hacia eso al tratar de elucidar el mecanismo de acción de 25-hidroxicolesterol.
Septiembre 18, 2008
Este semestre me dedicaré a la revisión de datos obtenidos con la técnica de Western Blot para medir las expresión de dos proteínas, APE y MnSOD2. Esta técnica consiste, luego de la extracción de proteínas de las células que utilizamos como modelo experimental, en correr las muestras en una gelatina de acrilamida y luego transferir las proteínas a una membrana de nitrocelulosa. El siguiente paso consiste en utilizar anticuerpos, primario y secundario, para marcar las proteínas de interés, las cuales se pueden observar al tomarle una foto a la membrana. Entonces es posible cuantificar la cantidad de proteína utilizando un programa de computadora.
En cuanto al progreso relacionado con mis objetivos para este semestre, considero que he logrado algo de progreso (2) ya que la organización de tantos datos en Excel toma bastante tiempo. Además, mi mentora me propuso preparar una presentación formal para los miembros de mi laboratorio al final del semestre, la cual no podré comenzar a preparar hasta terminar de organizar mis datos.
Agosto 25, 2008
Todavía no he tenido la oportunidad de reunirme con mi mentora para acordar las metas para este semestre ya que ella se encuentra de viaje. Hasta ahora teníamos planificado continuar con los experimentos del semestre pasado, pero todavía no he tenido la oportunidad de confirmar esto con ella. Este semestre existe la complicación de un itinerario académico más cargado, ya que es el último año de mi bachillerato. Esto implica mayor organización en mi horario, ya que el procedimiento de western blotting es muy largo, así que definitivamente eso será un reto. Por ahora queda reunirme con la Dra. Ayala para acordar lo que se hará hasta diciembre de este año; hasta entonces los mantendré informados.
Abril 26, 2008
Este semestre he aprendido nuevas técnicas de laboratorio así como la paciencia y dedicación que se requieren para hacer trabajo de investigación. El mayor reto como tal que he enfrentado ha sido estandarizar el uso del sistema de transferencia semi-seco para membranas de Western Blot. Los procesos de estandarización pueden ser un poco tediosos, pero de suma importancia para el proceso investigativo y la obtención de resultados confiables. Todavía me encuentro en este proceso, ya que deseo lograr la mejor transferecia posible. Sin embargo, ya he comenzado a generar datos, lo que queda ahora es la acumulación de un número considerable de experimentos para confirmar que los resultados que estoy obteniendo son estadísticamente significativos. Este es entonces el trabajo que me espera el próximo semestre.
Técnicas de laboratorio Marzo 27, 2008
La técnica que he estado aprendiendo ultimamente en el laboratorio es la de Western blotting. La misma consiste en separar proteínas por medio de electroforesis, transferirlas a una membrana y luego incubar esta última con anticuerpos para seleccionar la proteína de interés. De esta forma, es posible detectar la presencia de la proteína en la muestra y cuantificarla luego con la ayuda de un programa de computadora. En mi caso, la proteína de interés es la dismutasa de superóxido, cuya expresión aumenta en presencia de radicales libres. Esto se debe a que, según nuestra hipótesis, 25-hidroxicolesterol induce apoptosis en las células linfoides mediante la producción de radicales libres. Para esto, estamos utlilizando dos clonos de células linfoides, uno sensitivo y otro resistente a 25-hidroxicolesterol y comparando la expresión de la proteína en ambos.
